Di kehidupan baru yang tenang tanpa kebisingan tiba-tiba berubah seketika saat ia direkrut oleh Lucy Wilde dan Silas Ramsbottom dan dibawa ke markas besar Liga Anti-Kejahatan, organisasi yang didedikasikan untuk memerangi kejahatan dalam skala global.
Di sana, ia menemukan bahwa ada penjahat baru yang dilepas. Karena Gru dulunya seorang penjahat dan dia tahu bagaimana jalan pikiran para penjahat tersebut. Silas (Kepala Liga), menginginkan Gru untuk membantu mereka melawan penjahat. Dengan bantuan asisten Gru, Dr Nefario, antek-anteknya, Margo, Edith, dan Agnes, Gru harus menyelamatkan dunia (lagi).
Laboratorium rahasia di dekat Lingkar Arktik dicuri oleh kendaraan misterius menggunakan magnet raksasa. Anti-Villain League (AVL) merekrut Gru, dahulu penjahat super, kini seorang pembuat jelly baik hati, untuk menemukan orang jahat yang akan mulai menggunakan mutagen PX-41 untuk menghasilkan monster yang tak dapat dihancurkan dan sangat agresif. Gru dan agen AVL rahasia Lucy harus mencari Perbelanjaan Paradise, dan mereka diberi toko roti sebagai markasnya. Gru mencurigai Eduardo, pemilik restoran Meksiko, sebagai penjahat super yang diduga secara kuat telah meninggal, bernama "El Macho"; Gru dan Lucy membobol masuk ke restoran Eduardo pada malam hari, namun tidak menemukan hal yang memberatkan. Kemudian Gru dan Lucy menyelidiki pedagang wig Floyd Eagle-san, sementara Margo, anak perempuan Gru, sungguh jatuh cinta pada anak laki-laki muda Eduardo yang tampan.
Hari berikutnya, AVL menangkap Floyd Eagle-san karena botol mutagen yang hampir kosong ditemukan di dalam tokonya. Penyelidikan ditutup, dan Lucy ditugaskan kembali ke Australia. Ketika Gru mengetahuinya, dia patah hati; dia mencintai Lucy, namun dia tidak dapat memiliki keberanian untuk mengajaknya pergi berkencan. Dia datang ke pesta Eduardo, dan menemukan bukti bahwa pemilik restoran Meksiko ini sebenarnya adalah penjahat super El Macho. Gru juga menemukan bahwa El Macho (dan pembantunya, sebelumnya asisten dan teman Gru, Dr. Nefario) telah merebut dan memutasikan sejumlah besar minion Gru, mengubahnya menjadi monster galak berbulu ungu. El Macho berencana mengirimkan roket yang penuh minion yang bermutasi ke kota-kota besar dan meraih kekuasaan di seluruh dunia. El Macho mengakui pekerjaan lama Gru (misalnya mencuri bulan), dan mengundang Gru untuk bergabung dengannya dalam rencananya, tetapi Gru menolak untuk menjawab, dan pergi bersama anak perempuannya, Margo, yang telah putus dengan anak laki-laki Eduardo.
Pada penerbangannya ke Australia, Lucy menyadari bahwa dia tidak dapat hidup tanpa Gru, dan melompat keluar dari pesawat terbang menggunakan layang gantung. Dia ditangkap oleh El Macho, yang kini mengetahui bahwa dia adalah agen AVL. Beruntung, Dr. Nefario memberi tahu Gru tentang apa yang sedang terjadi. Untuk menyelamatkan Lucy, Gru mengunjungi El Macho bersama dua minion yang dicat ungu, berpura-pura dia telah ditangkap oleh dua makhluk mutan. Bertarung di sisi anak-anak perempuannya dan Dr. Nefario, Gru dan timnya menyemprot seluruh minion yang bermutasi dengan antidot sangat kuat yang dicampur dengan jelly, sehingga mereka kembali menjadi kuning dan ramah. Kemudian El Macho mengambil mutagen untuk dirinya sendiri, tetapi Gru dan Dr. Nefario dengan mudah mengatasinya dengan menggunakan senapan angin busuk.
Namun, Lucy telah diikat ke roket hiu bermuatan TNT. Gru mulai melepaskan ikatan Lucy, namun tombol kendali peluncuran roket ditekan oleh Pollito, ayam peliharaan El Macho. Roket meluncur ke muntahan lava gunung berapi yang sama dengan tempat El Macho sebelumnya mengelabui kematiannya. Lucy menerima undangan Gru untuk berkencan, dan pasangan itu menyelam dengan selamat ke lautan dua detik sebelum roket masuk ke gunung berapi.
Seratus empat puluh tujuh hari kemudian, Gru dan Lucy menikah dan anak-anak perempuan Gru akhirnya mempunyai seorang ibu. Para minion menutupnya dengan membawakan "Y.M.C.A." dan "I Swear" (dinyanyikan dengan suara minion) sementara seluruh keluarga menari.
